關於real-time PCR的問題 - 生技

我以前是做RT-real time PCR
也是用SYBR Green做的~
我用過PRIMER濃度從100nM~900nM
(每家kit建議的濃度不太依樣)
個人覺得濃度越高primer dimer比較嚴重
有時連negative control也會有訊號
我不太喜歡這樣的DATA
在我的實驗中
降低primer濃度只是會讓終產物變少
對過threshold的Ct並沒有影響
不過還是建議每次跑realtime都要放positive/negative control


※ 引述《frela (漫步北台灣)》之銘言：
: 您好,我是某公司的產品專員,
: 根據敝公司的SYBR Green supermix KIT標準操作手冊中指出,
: primer的終濃度一般最好是介於100~500 nM 左右
: 而您文中之意是貴老師認為最好終濃度在500 nM
: 而您"不小心"只用了終濃度50 nM
: 基本上,若不考慮不同產品的優劣性...
: 您用的量,"會不會太少?"
: 這個問題...我想很少人可以回答,因為不同的檢體或樣本
: 都有可能有其最佳的條件存在,primer也是一個需要考量的條件,
: (比如說primer 的濃度低,是可以有效降低primer dimer的問題...
: 不過這是不得已的解決辦法...)
: 關鍵在於一般像QPCR這種相當敏感的實驗來說..
: 您的positive control及negative control能不能有效證明您的實驗是合理的,
: 才是重點!
: 如果之前沒有設定的話
: 您就重新各設定一個positive control及negative control來證明...
: 若依我不負責任的說法...我倒覺得根本沒差多少,只是最低濃度的二分之一?
: 論文中明確著明方法即可...
: ※ 引述《candy315 (沉澱)》之銘言：
: : 各位大大好，我是某大學的碩士生
: : 我想請教關於real-time PCR的問題
: : 大部份的實驗...都會用RNA轉cDNA然後再做real-time PCR
: : 但我的template是genomic DNA
: : 也有聽說genomic DNA的real-time比較不好做..
: : 然後，一個大問題來了
: : 我們老闆說，primer的量通常是總體積的1/10左右
: : 所以我先用一般PCR在測試primer時，我是用5uM的primer，然後每管取2.5ul
: : (total volumn為25ul)
: : 但做real-time時，因為我陰錯陽差的失誤
: : 一直以來，我都是用5um的primer，然後每管加0.25ul
: : (total volumn亦為25ul)
: : 我想請問大家，有人用過這麼少量的primer嗎??
: : 因為我的實驗其實已經快結束了...如果我之前的primer量真的加的太少，
: : 那我可能所有實驗要重做了....orz
: : 所以我想請問各位有經驗的大大，有人也是和我一樣，用類似的量做real-time PCR的嗎
: : PS，我用的kit是 SYBR的kit

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